Agarose é um polissacarídeo natural amplamente utilizado em biologia molecular como matriz para eletroforese de ácidos nucleicos devido às suas únicas propriedades físicas e químicas. A eletroforese em gel de agarose permite a separação de moléculas de DNA e RNA principalmente baseada no tamanho, aproveitando a cadeia de fosfato negativamente carregada dos ácidos nucleicos que migram em direção ao ânodo em um campo elétrico. A molécula de agarose em si consiste em unidades repetidas de agarobiose — resíduos alternados de D- e L-galactose — que formam uma matriz de gel porosa ao resfriar, criando uma estrutura de peneiramento que restringe diferencialmente a mobilidade dos ácidos nucleicos de acordo com o comprimento do fragmento.
A natureza porosa dos géis de agarose, que aumenta com concentrações mais baixas (comumente 0,7–2 %), permite a separação efetiva de fragmentos de ácidos nucleicos variando de aproximadamente 100 pares de bases até 25 quilobases ou mais. A força do gel e as temperaturas de fusão/gelação são características físicas importantes; concentrações mais altas de agarose aumentam a força do gel e o ponto de gel, produzindo géis mais robustos para manuseio. Variantes de agarose de baixo ponto de fusão facilitam manipulações enzimáticas diretamente no gel após a separação.
Eletroendosmose (EEO) e Propriedades da Agarose
Um fator crítico que influencia o desempenho eletroforético é a eletroendosmose da agarose (EEO), que surge de grupos negativamente carregados como resíduos de sulfato e piruvato no polímero de agarose. Essas cargas induzem um fluxo contracorrente de água durante a eletroforese que pode retardar a migração de ácidos nucleicos e reduzir a resolução das bandas. Portanto, agaroses de baixa EEO são preferidas para eletroforese em gel de ácidos nucleicos para melhorar a nitidez das bandas e a reprodutibilidade, e minimizar contaminações que poderiam interferir em processos downstream como PCR e ligação.
Migração e Visualização de Ácidos Nucleicos
Durante o processo de eletroforese, ácidos nucleicos carregados em poços do gel de agarose migram através da matriz de gel sob um campo elétrico aplicado. Dada a relação uniforme de carga-massa dos ácidos nucleicos, essa taxa de migração é inversamente proporcional ao logaritmo do tamanho molecular, permitindo separação baseada no tamanho. A visualização pós-separação é comumente alcançada com corantes intercalantes e iluminação UV, permitindo análise qualitativa e quantitativa de amostras de ácidos nucleicos.
A eletroforese em gel de agarose permanece uma técnica fundamental em biologia molecular devido à excelente força do gel da agarose, à estrutura de poro ótima, à baixa fluorescência de fundo e às propriedades de EEO controláveis, facilitando uma separação e análise eficiente e fácil de manusear de ácidos nucleicos.
