L'agarose est un polysaccharide naturel largement utilisé en biologie moléculaire comme matrice pour l'électrophorèse des acides nucléiques en raison de ses propriétés physiques et chimiques uniques. L'électrophorèse sur gel d'agarose permet la séparation des molécules d'ADN et d'ARN principalement en fonction de leur taille, en tirant parti de la charge négative de leur squelette phosphate qui migre vers l'anode sous champ électrique. La molécule d'agarose est constituée d'unités répétitives d'agarobiose — résidus alternés de D- et L-galactose — qui forment, après refroidissement, une matrice gélifiée poreuse créant une structure de tamisage qui limite différemment la mobilité des acides nucléiques selon la longueur des fragments.
La porosité des gels d'agarose, qui augmente avec des concentrations plus faibles (généralement 0,7 à 2 %), permet une séparation efficace des fragments d'acides nucléiques allant d'environ 100 paires de bases jusqu'à 25 kilobases ou plus. La résistance du gel et les températures de fusion/gélification sont des caractéristiques physiques importantes ; des concentrations plus élevées d'agarose augmentent la résistance du gel et le point de gélification, produisant des gels plus robustes pour la manipulation. Les variantes d'agarose à faible point de fusion facilitent les manipulations enzymatiques directement dans le gel après séparation.
Électroendosmose (EEO) et propriétés de l'agarose
Un facteur critique influençant la performance électrophorétique est l'électroendosmose (EEO) de l'agarose, résultant de la présence de groupes chargés négativement tels que les résidus sulfate et pyruvate sur le polymère d'agarose. Ces charges induisent un flux d'eau inverse lors de l'électrophorèse pouvant ralentir la migration des acides nucléiques et réduire la résolution des bandes. Par conséquent, les agaroses à faible EEO sont préférées pour l'électrophorèse des acides nucléiques afin d'améliorer la netteté et la reproductibilité des bandes, et de minimiser les contaminations pouvant interférer avec des processus en aval tels que la PCR et la ligature.
Migration et visualisation des acides nucléiques
Lors de l'électrophorèse, les acides nucléiques chargés dans les puits du gel migrent à travers la matrice sous l'effet du champ électrique appliqué. Étant donné le rapport charge/masse uniforme des acides nucléiques, la vitesse de migration est inversement proportionnelle au logarithme de la taille moléculaire, permettant une séparation basée sur la taille. La visualisation post-séparation est généralement réalisée à l'aide de colorants intercalants et d'illumination UV, permettant une analyse qualitative et quantitative des échantillons d'acides nucléiques.
L'électrophorèse sur gel d'agarose demeure une technique fondamentale en biologie moléculaire grâce à l'excellente résistance des gels d'agarose, leur structure poreuse optimale, leur faible fluorescence de fond et leurs propriétés EEO contrôlables, facilitant une séparation et une analyse efficaces et faciles à manipuler des acides nucléiques.
