Protocolo de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Introdução

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A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica fundamental em biologia molecular, permitindo a amplificação de sequências específicas de DNA a partir de quantidades mínimas de material inicial. Desde sua invenção por Kary Mullis em 1983, a PCR revolucionou a pesquisa genética, diagnósticos, forense e biotecnologia. Este protocolo fornece um guia abrangente para realizar a PCR padrão, incluindo etapas detalhadas, especificações de reagentes, solução de problemas e estratégias de otimização.

 

Princípio da PCR

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A PCR é um processo enzimático que amplifica um segmento específico de DNA por meio de ciclos repetidos de desnaturação, anelamento e extensão. A reação depende de uma DNA polimerase termoestável, geralmente a Taq polimerase, que resiste às altas temperaturas necessárias para desnaturar o DNA de dupla hélice (Figura 1).

Figura 1: Processo de Amplificação por PCR

• Desnaturação: O DNA é aquecido a 94–98°C, quebrando as ligações de hidrogênio para produzir DNA de fita simples.
• Anelamento: A temperatura é reduzida para 50–68°C, permitindo que os primers se liguem às sequências complementares que flanqueiam o DNA alvo.
• Extensão: A temperatura é elevada para 72°C, ideal para a Taq polimerase sintetizar novas fitas de DNA ao adicionar desoxirribonucleotídeos trifosfatos (dNTPs).

 

Materiais e Equipamentos

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Antes de começar, certifique-se de que todos os reagentes e equipamentos estejam disponíveis e armazenados adequadamente. Use reagentes de grau biologia molecular para evitar contaminação ou inibição.

 

Protocolo de PCR

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Etapa 1: Desenho e Preparação de Primers

Os primers são oligonucleotídeos de DNA de fita simples (18–25 bases) que flanqueiam a sequência alvo e servem como pontos de partida para a síntese de DNA. O desenho adequado dos primers é crucial para uma amplificação específica e eficiente.

Diretrizes para Desenho de Primers

Use ferramentas de software para desenhar primers. Siga estes critérios:

• Comprimento: 18–25 bases. Primers mais curtos (<18) podem faltar especificidade; primers mais longos (>25) podem formar estruturas secundárias.
• Temperatura de Fusão (Tm): 55–65°C, com primers forward e reverse dentro de 2°C um do outro. Calcule o Tm usando a fórmula para uma estimativa básica ou use software para maior precisão (considera sal e concentração de primers).

Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)

• Conteúdo GC: 40–60%. Evite extremos (<30% ou >70%) para evitar anelamento fraco ou estruturas secundárias.
• Extremidade 3': Termine com G ou C (pareamento de bases mais forte) e evite sequências de três ou mais bases idênticas (por exemplo, GGG) para reduzir erros de anelamento.
• Especificidade: Verifique a especificidade usando o NCBI BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov) para garantir que os primers se liguem apenas à sequência alvo. Evite homologia com regiões não-alvo.
• Estruturas Secundárias: Evite grampos, auto-dímeros e hetero-dímeros. O Delta G para dímeros deve ser >-5 kcal/mol.
• Tamanho do Amplicon: Desenhe para amplicons de 100–1000 bp para PCR padrão. Amplicons mais longos (até 5 kb) são possíveis, mas requerem otimização.
• Evite Repetições: Não coloque primers em regiões com sequências repetitivas ou de baixa complexidade (por exemplo, ATATAT).

Síntese e Armazenamento de Primers

• Encomenda: Encomende primers purificados por HPLC. A purificação por HPLC garante alta pureza, reduzindo amplificação inespecífica.
• Ressuspensão: Ressuspender primers liofilizados em tampão TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) para uma concentração de estoque de 100 µM.
• Solução de Trabalho: Diluir o estoque para 10 µM em água livre de nuclease. Armazenar a -20°C.
• Armazenamento: Armazenar estoques de 100 µM a -20°C por até 1 ano; soluções de trabalho de 10 µM são estáveis a -20°C por 6 meses ou a 4°C por 1 mês. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento (>10) para prevenir degradação.

Controle de Qualidade de Primers

• Quantificação: Verifique a concentração do primer usando um espectrofotômetro (A260). A absorbância esperada para 100 µM é ~0.3–0.5, dependendo da sequência.
• Integridade: Opcional—execute os primers em um gel de agarose 2% para confirmar ausência de degradação (deve aparecer como uma banda única e nítida).
• Teste de Amplificação: Realize uma PCR de teste com um modelo conhecido para confirmar a funcionalidade do primer antes de experimentos em grande escala.

Etapa 2: Configuração da Reação

A mistura de reação de PCR contém todos os componentes necessários para a amplificação de DNA. O protocolo fornecido é dimensionado para um volume de reação de 50 µL, com uma mistura mestre para 11 reações (10 amostras + 1 controle sem modelo) para compensar perdas de pipetagem.

Componentes da Reação

A tabela abaixo lista os reagentes e volumes para uma reação de 50 µL e a mistura mestre para 11 reações.

Reagente	Volume por Reação (µL)	Total para 11 Reações (µL)
Água Livre de Nuclease	36.5	401.5
Tampão PCR 10X	5.0	55.0
dNTPs (10 mM cada)	1.0	11.0
MgCl₂ (25 mM)	3.0	33.0
Primer Forward (10 µM)	1.0	11.0
Primer Reverse (10 µM)	1.0	11.0
Taq Polimerase (5 U/µL)	0.5	5.5
DNA Modelo (variável)	3.0	Adicionar separadamente

Etapa 3: Ciclagem Térmica

O ciclador térmico submete a reação a mudanças repetidas de temperatura para facilitar a desnaturação, anelamento e extensão. As condições de ciclagem fornecidas são otimizadas para PCR padrão com Taq polimerase e amplicons de 100–1000 bp.

NeoCycler Trio - Ciclador Térmico Multi-bloco (Cat# NB-12-3024) NeoCycler Duo - Ciclador Térmico Multi-bloco (Cat# NB-12-3025)		NeoCycler 300 - Ciclador Térmico de Gradiente Rápido (com módulo 9677 / 96) (Cat# NB-12-3001) NeoCycler 200 - Ciclador Térmico de Gradiente (Cat# NB-12-3002) NeoCycler 100 - Ciclador Térmico Não-Gradiente (com módulo 9677 / 96) (Cat# NB-12-3003)
NeoCycler 600 - Ciclador Térmico Super Gradiente (Cat# NB-12-3026)		NeoCycler Mini (Cat# NB-12-3029-2)

Programa de Ciclagem Térmica

Programe o ciclador térmico com os seguintes passos:

1. Desnaturação Inicial: 95°C por 2 minutos
   • Desnatura o DNA modelo de dupla hélice e ativa a Taq polimerase (versões de hot-start podem exigir mais tempo, por exemplo, 5–10 minutos).
2. Ciclagem (30–35 ciclos):
   • Desnaturação: 95°C por 30 segundos
     • Separa as fitas de DNA. Tempos mais curtos (15–20 segundos) podem ser suficientes para modelos pequenos (por exemplo, plasmídeos).
   • Anelamento: 55–65°C por 30 segundos
     • Os primers se ligam às sequências complementares. Defina 2–5°C abaixo do Tm do primer inferior (por exemplo, se o Tm for 60°C, use 55–58°C). Otimize se necessário (veja a Seção 8).
   • Extensão: 72°C por 1 minuto por kb
     • A Taq polimerase sintetiza novo DNA. Para um amplicon de 500 bp, use 30–60 segundos; para 1 kb, use 60 segundos. Mínimo de 30 segundos para <500 bp.
3. Extensão Final: 72°C por 5 minutos
   • Completa extensões parciais e adiciona extremidades 3' A (útil para clonagem TA).
4. Manutenção: 4°C indefinidamente
   • Armazena as reações até a retirada. Evite armazenamento prolongado (>24 horas) para prevenir degradação.

Número de Ciclos

• Padrão: 30 ciclos para quantidades moderadas de modelo (10–50 ng de DNA genômico).
• Modelo Baixo: 35 ciclos para quantidades baixas de modelo (<1 ng) ou cDNA.
• Modelo Alto: 25–28 ciclos para quantidades altas de modelo (>100 ng) para reduzir produtos inespecíficos.
• Ciclos Excessivos: >35 ciclos podem aumentar a amplificação inespecífica ou dímeros de primers.

Configurações do Ciclador Térmico

• Temperatura da Tampa: Defina para 105°C para evitar condensação.
• Taxa de Rampa: Use configurações padrão (2–5°C/segundo). Rampas mais rápidas podem exigir ajustes para máquinas mais antigas.
• Volume: Defina para 50 µL no programa do ciclador para aquecimento preciso.

Variações

• Amplicons Curtos (<200 bp): Reduza o tempo de extensão para 15–30 segundos.
• Amplicons Longos (1–5 kb): Aumente o tempo de extensão (1–2 minutos/kb) e considere polimerases de alta fidelidade.
• Modelos Ricos em GC: Use temperaturas de desnaturação mais altas (98°C) ou aditivos como DMSO (5–10%).

Etapa 4: Análise dos Produtos de PCR

Após a PCR, analise os produtos para confirmar o sucesso da amplificação e o tamanho do amplicon. A eletroforese em gel de agarose é o método padrão.

Preparação do Gel de Agarose

1. Concentração do Gel:
   • 1% de agarose para amplicons de 500–5000 bp.
   • 1.5–2% de agarose para amplicons de 100–500 bp.
2. Preparar o Gel:
   • Pese a agarose.
   • Dissolva em tampão TAE 1X (40 mM Tris, 20 mM ácido acético, 1 mM EDTA) por aquecimento no micro-ondas até ficar transparente.
   • Esfrie a ~50°C, adicione SYBR Safe (1 µL por 10 mL de gel, conforme o fabricante) e despeje em uma bandeja de fundição com pente.
   • Deixe solidificar por 20–30 minutos.
3. Configuração: Coloque o gel em um tanque de eletroforese preenchido com tampão TAE 1X.

Preparação da Amostra

1. Misturar a Amostra: Combine 10 µL de produto de PCR com 2 µL de corante de carga 6X (final 1X).
2. Carregar a Escada: Carregue 5–10 µL de escada de DNA (100 bp ou 1 kb, dependendo do tamanho do amplicon) em uma pista.
3. Carregar as Amostras: Carregue 12 µL de cada produto de PCR + mistura de corante em poços separados. Inclua o Controle Sem Modelo (NTC) para verificar contaminação.

Eletroforese

• Executar o Gel: Execute a 80–120 V por 30–60 minutos, até que o corante de carga (azul de bromofenol) migre ~2/3 do comprimento do gel.
• Visualizar: Use um transiluminador UV (ou luz azul para SYBR Safe) para visualizar as bandas. Fotografe o gel para documentação.

Interpretação

• Banda Esperada: Compare o tamanho da banda com a escada de DNA. Deve corresponder ao tamanho previsto do amplicon (com base no desenho do primer).
• NTC: Não devem aparecer bandas na pista do NTC. Bandas indicam contaminação ou dímeros de primers.
• Borramento: Indica amplificação inespecífica, modelo degradado ou excesso de DNA.
• Sem Bandas: Sugere falha na amplificação.

Pós-Análise

• Armazenamento: Armazene os produtos de PCR a -20°C por semanas ou a 4°C por 1–2 dias.
• Purificação: Para aplicações posteriores (por exemplo, sequenciamento, clonagem), purifique os produtos usando um kit de limpeza de PCR ou kit de extração de gel.
• Quantificação: Meça a concentração do produto usando um Nanodrop ou fluorômetro, se necessário.

 

Controle de Qualidade e Validação

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Para garantir resultados confiáveis, incorpore controle de qualidade em cada etapa.

Qualidade do Modelo

• Pureza: Uma razão A260/A280 de 1.8–2.0 indica DNA puro. Razões mais baixas sugerem contaminação por proteína ou RNA.
• Integridade: Execute o DNA modelo em um gel de agarose 0.8% para confirmar ausência de degradação (o DNA genômico deve aparecer como uma banda de alto peso molecular).
• Concentração: Use 10–100 ng de DNA genômico ou 0.1–1 ng de DNA plasmidial por reação de 50 µL.

Qualidade dos Reagentes

• dNTPs: Verifique a degradação (armazene a -20°C, evite >10 ciclos de congelamento-descongelamento).
• Taq Polimerase: Verifique a atividade testando com um par de primer-modelo conhecido.
• Primers: Confirme concentração e integridade.

Controles

• NTC: Detecta contaminação ou dímeros de primers.
• Controle Positivo: Use um par de primer-modelo conhecido para confirmar as condições da reação.
• Controle Negativo (opcional): Omita a polimerase para verificar amplificação inespecífica.

Análise de Gel

• Escada: Certifique-se de que a escada resolve claramente para confirmar a qualidade do gel.
• Intensidade da Banda: Bandas fortes e únicas indicam amplificação bem-sucedida. Bandas fracas ou múltiplas sugerem a necessidade de otimização.

 

Solução de Problemas

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A PCR pode exigir otimização para alcançar amplificação específica e de alto rendimento. Abaixo estão os problemas comuns e soluções.

Sem Amplificação

• Causa: Baixa concentração do modelo, modelo degradado, primers incorretos ou temperatura de anelamento inadequada.
• Soluções:
  • Aumente o modelo (até 200 ng) ou ciclos (até 35).
  • Verifique a integridade do modelo em um gel.
  • Confirme as sequências dos primers e o Tm; redesenhe se necessário.
  • Realize uma PCR de gradiente (50–65°C de anelamento) para encontrar a temperatura ideal.
  • Verifique a atividade da Taq polimerase com um controle positivo.

Bandas Inespecíficas

• Causa: Temperatura de anelamento baixa, alta concentração de MgCl₂, excesso de primers ou ligação inespecífica de primers.
• Soluções:
  • Aumente a temperatura de anelamento em incrementos de 1–2°C.
  • Reduza o MgCl₂ para 1–1.2 mM.
  • Diminua a concentração de primers para 0.1–0.15 µM.
  • Redesenhe os primers para maior especificidade (use BLAST).
  • Reduza o número de ciclos para 25–28.

Borramento

• Causa: Excesso de modelo, modelo degradado ou excesso de ciclos.
• Soluções:
  • Reduza o modelo para 10–50 ng.
  • Verifique a integridade do modelo.
  • Diminua os ciclos para 25–30.
  • Use dNTPs e polimerase frescos.

Dímeros de Primers

• Causa: Primers formando auto- ou hetero-dímeros, visíveis como bandas de baixo peso molecular (<100 bp) no NTC.
• Soluções:
  • Redesenhe os primers para minimizar a formação de dímeros.
  • Reduza a concentração de primers para 0.1 µM.
  • Aumente a temperatura de anelamento.
  • Use Taq polimerase de hot-start para prevenir anelamento inespecífico durante a configuração.

Estratégias de Otimização

• PCR de Gradiente: Teste uma faixa de temperaturas de anelamento (por exemplo, 50–65°C) em uma única execução se o ciclador suportar a função de gradiente.
• Titulação de MgCl₂: Teste 1–4 mM de MgCl₂ em incrementos de 0.5 mM.
• Aditivos: Para modelos ricos em GC, adicione 5–10% de DMSO ou betaína (1–2 M) à reação.
• PCR Hot-Start: Use Taq de hot-start (por exemplo, Platinum Taq) para reduzir amplificação inespecífica durante a configuração.
• PCR Touchdown: Inicie o anelamento 5–10°C acima do Tm, diminuindo 0.5°C por ciclo por 10 ciclos, depois continue na temperatura mais baixa. Aumenta a especificidade.

 

Conclusão

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Este protocolo de PCR abrangente fornece uma estrutura robusta para amplificar DNA com alta especificidade e rendimento. Ao seguir as etapas detalhadas para desenho de primers, configuração da reação, ciclagem térmica e análise de produtos, os usuários podem obter resultados confiáveis para uma ampla gama de aplicações. Dicas de otimização e solução de problemas garantem o sucesso mesmo com modelos ou primers desafiadores. Para aplicações avançadas, adapte o protocolo conforme descrito e consulte as diretrizes do fabricante para reagentes ou equipamentos especializados.