Algemeen protocol voor flowcytometrie

I. Vereist materiaal
Reagentia
- Een primair antichaam , tegen de doelmolecule
- Een Fc-receptorblokker: "Anti-CD16/32, blokkeert Fc-binding" die niet-specifiek bindt aan primaire antilichamen.
- Een secundair antilichaam bij indirecte kleuring met een niet-gelabeld primair antilichaam
- Een niet-relevant controle-isotype met een vergelijkbaar label als het primaire antilichaam

Buffers
- Een kleuringbuffer
- Een intracellulaire fixatiebuffer
- Trypan blauw voor het tellen van cellen
- Gaines mantelvloeistof

Materiaal

- Pipetten en Pipet-aid
- Centrifugator
- Vriezer
- Flowcytometer


II. Experimenteerlengte
- 30 mn monstervoorbereiding en antilichaamverdunningen
- 30 mn tot 1 uur antilichaamincubatie
- 30 mn aan 1 h van steekproeven die met de cytometer van de stroom lezen (hangt van aantal steekproeven, concentratie van cel en de cytometercapaciteit af)
- Totaal : 3 tot 4 uur


III. Protocol
- Verdun primair antilichaam en controleisotype in 50 µl assaybuffer om de gewenste concentratie te respecteren die na antilichaamtitratie wordt geoptimaliseerd
- Incubeer 50 µl celpreparaat in 50 µl antilichaampreparaat of controle-isotype in een plaat met 96 putten
- Incubeer gedurende 15-30 mn bij 4°c in een donkere kamer

Opmerking : U moet de incubatietijd van antilichamen optimaliseren met betrekking tot hun affiniteit met het antigeen.

- Voeg 200 µl van assaybuffer toe om de reactie te stoppen
- Centrifugeer de cel in suspensie gedurende 5 mn (300 - 400g) bij +4°c en gooi het supernatant weg
- Herhaal tweemaal de wasstappen met 200 µl van assaybuffer-centrifugeer celsuspensie 5 min (300-400g) bij 4°c

Optionneel : Herhaal voor indirecte kleuring de kleuringstap met secundair antilichaam met hetzelfde protocol en vergelijkbare waarnemingen
- Resuspenderen in 500 µl assaybuffer of fixatiebuffer aangevuld met 2% formaldehyde
- Cellen lezen in een flowcytometer


IV. Zoekmachine
- Primaire antilichamen
- Secundaire antilichamen