PCR Conventionnelle

PCR Conventionnelle



La PCR (Polymerase Chain Reaction) est un test in vitro pour la réplication de l'ADN qui permet à une séquence "cible" d'ADN d'être sélectivement amplifiée plusieurs millions de fois en quelques heures.

Une réaction de PCR classique nécessitent différents composants et réactifs. Ces composants inclus :

  • Echantillon d'ADN contenant la région d'ADN (Cible) à amplifier
  • ADN polymerase, qui doit être résistante à la température pour pouvoir rester intacte pendant le processus de dénaturation de l'ADN
  • 2 amorces (primers) qui sont complémentaires des extrémités 3' des brins sens et anti-sens de l'ADN cible (l'ADN polymérase peut uniquement se lier et procéder à l'élongation d'un double brin d'ADN et sans les amorces l'élongation est impossible)
  • Desoxynucléotides triphosphate (dNTP), qui représentent les briques de construction nécessaire à l'ADN polymérase pour synthétiser un nouveau brin d'ADN
  • Solution tampon, qui apporte un environnement chimique suffisant pour une activité et une stabilité optimale de l'ADN polymérase
  • Cations bivalents, ions magnésium ou manganèse. Généralement se sont les ions Mg2+ qui sont utilisés mais les ions Mn2+ peuvent également être utilisés pour la mutagenèse
  • Ions potassium monovalents

Typiquement, la PCR consiste en une série de 20-40 changements de température, appelés cycles. Chaque cycle consiste en 2-3 étapes à températures différentes. Les cycles sont précédés par une étape à haute température (>90 °C), et suivis une étape finale d'extension. Les températures utilisées ainsi que le temps appliqués à chaque cycle dépendent de plusieurs paramètres. Ceci inclu l'enzyme utilisée pour la synthèse de l'ADN, la concentration des ions divalents et des dNTPs et la température d'hybridation (Tm) des amorces.

  • Etape d'initialisation (uniquement pour les ADN polymérases qui nécessitent une activation par température (Hot-Start PCR) : Cette étape se fait à une température de 94-96°C (ou 98°C pour les polymérases extrêmement thermostables) pendant 1-9 minutes.
  • Etape de dénaturation : Cette étape est le premier événement d'un cycle, elle se fait à une température de 94-98°C pendant 20-30 secondes. Ceci provoque la dénaturation de l'ADN en cassant les liaisons hydrogène entre les bases complémentaires, on a alors 2 molécules d'ADN simple brin.
  • Etape d'hybridation: La temprérature de cette étape est plus faible (60-65°C pendant 20-40 secondes) pour permettre l'hybridation des amorces sur les brins d'ADN.
  • Etape d'élogation : he La température de cette étape dépend de l'ADN polymérase utilisée : la Taq polymérase a une activité maximale à 75-80°C, la température de 72°C est le plus souvent utilisée. A cette étape, l'ADN polymérase synthétise un nouveau brin complémentaire en ajoutant des dNTPs complémentaire à la séquence cible dans la direction 5'-3'. Le temps d'élongation dépend à la fois l'ADN polymérase utilisée et de la longueur du fragment à amplifier.