Fosfofructokinase (PFK) is een cruciale regulerende enzym in de glycolyse, die de conversie van fructose-6-fosfaat naar fructose-1,6-bisfosfaat katalyseert. Het nauwkeurig meten van de PFK-activiteit is essentieel voor het bestuderen van cellulair energiemetabolisme en de verstoring ervan bij ziekten zoals kanker en metabole stoornissen.

Biologische rol van fosfofructokinase

PFK katalyseert de fosforylatie van fructose-6-fosfaat met behulp van ATP, waarbij fructose-1,6-bisfosfaat en ADP worden geproduceerd—een praktisch onomkeerbare stap die glucose aan de glycolyse verbindt. Deze reactie wordt sterk gereguleerd door allosterische effectoren, waaronder ATP (inhibitor), AMP (activator) en fructose-2,6-bisfosfaat, de laatste is een krachtige activator die glycolyse koppelt aan hormonale en nutritionele signalen. PFK komt voor in verschillende isoformen (PFK-M, PFK-L, PFK-P), die de weefselspecifieke metabolische behoeften weerspiegelen.

Principes en methodologie van het assay

PFK-activiteit assays gebruiken doorgaans een gekoppelde enzymatische reactie. PFK zet fructose-6-fosfaat en ATP om in fructose-1,6-bisfosfaat en ADP. Het geproduceerde ADP wordt verder verwerkt door een enzymmengsel om AMP en NADH te genereren. De afname van NADH wordt gekleurimetrisch gemeten, meestal bij 340 nm, of via de vorming van een gekleurde stof met een sterke absorptie bij 450 nm. Dit maakt een gevoelige, kwantitatieve detectie van PFK-activiteit in verschillende biologische monsters mogelijk, waaronder serum, plasma, weefsels en gekweekte cellen.

Toepassingen in onderzoek en diagnostiek

• Metabolische studies: PFK-activiteit assays worden veel gebruikt om het glycolytische flux en het energiemetabolisme in gezondheid en ziekte te beoordelen.
• Ziekte-diagnostiek: Een tekort aan PFK-activiteit wordt geassocieerd met de glycogeenstapelingsziekte type VII (de ziekte van Tarui), terwijl verhoogde activiteit wordt gekoppeld aan de proliferatie van kankercellen.
• Geneesmiddelen screening: Deze assays zijn waardevol voor het screenen van verbindingen die glycolyse moduleren, met implicaties voor kankeronderzoek en metabool syndroom.

Kenmerken van het assay kit

• Gevoeligheid: Detectie bij lage concentratie, wat de analyse van monsters met lage concentratie mogelijk maakt.
• Snelheid: Assay tijden variëren van 15 tot 30 minuten, wat hoogdoorvoerstudies mogelijk maakt.
• Monster veelzijdigheid: Compatibel met een breed scala aan monster types, inclusief dierlijke weefsels en gekweekte cellen.
• Precisie: Lage intra- en inter-assay variabiliteit garandeert reproduceerbaarheid.

PFK-activiteit assay kits bieden een robuuste, gevoelige en snelle manier om een centraal regulerend punt in het tussenliggende metabolisme te onderzoeken. De toepassing ervan strekt zich uit over basaal metabolisch onderzoek, ziekte-diagnostiek en geneesmiddelenontdekking, waarbij het belang van het enzym in de cellulaire fysiologie en pathologie wordt benadrukt.