Citometria a flusso protocollo generale

I. Materiale richiesto
Reagente
- Un anticorpo primario , contro la molecola bersaglio
- Un bloccante del recettore Fc: "Anti-CD16/ 32, blocco Fc binding" che non lega specificamente gli anticorpi primari
- Un anticorpo secondario  nella colorazione indiretta con un anticorpo primario non marcato.
- Un isotipo di controllo non rilevante con un'etichetta simile all'anticorpo primario.

Buffer
- Un buffer di colorazione
- Un tampone di fissazione intracellulare
- Trypan blue per il conteggio delle cellule
- Gaines mantelvloeistof

Materiale
- Pipetten en Pipet-aid
- Centrifugazione
- Congelatore
- Citometro a flusso


II. Durata della sperimentazione
- 30 mn preparazione del campione e diluizioni dell'anticorpo
- 30 mn a 1 h di incubazione degli anticorpi
- 30 mn-1 h della lettura dei campioni con il citometro di flusso (dipende dal numero dei campioni, dalla concentrazione della cella e dalla capacità del citometro)
- TOTALE: da 3 a 4 ore


III. Protocollo
- Diluire l'anticorpo primario e l'isotipo di controllo in 50 µl di tampone di analisi per rispettare la concentrazione desiderata ottimizzata dopo la titolazione dell'anticorpo
- Incubare 50 µl di preparazione cellulare in 50 µl di preparazione anticorpale o isotipo di controllo in una piastra a 96 pozzetti
- Incubare per 15-30 mn a 4°c in una stanza buia

Nota : È necessario ottimizzare il tempo di incubazione degli anticorpi rispetto alla loro affinità con l'antigene

- Aggiungere 200 µl di tampone per fermare la reazione
- Cella di centrifugato in sospensione per 5 mn (300 - 400g) a +4°c e scartare il surnatante
- Ripetere due volte le fasi di lavaggio con 200 µl di sospensione tampone - centrifugato per 5 min (300-400g) a 4°c

Opzionale : Per la colorazione indiretta, ripetere la fase di colorazione con anticorpo secondario con lo stesso protocollo e osservazioni simili
- Risospendere 500 µl di tampone di dosaggio o tampone di fissazione integrato con il 2% di formaldeide
- Leggere le cellule in un citometro a flusso


IV. Motore
- Anticorpi primari
- Anticorpi secondari