La cytométrie en flux est une technique puissante utilisée pour l’analyse multiparamétrique rapide des caractéristiques physiques et chimiques de cellules ou particules individuelles en suspension. Elle repose sur des anticorps marqués par fluorescence permettant d’identifier et de quantifier des protéines et d’autres marqueurs cellulaires.
Aperçu du protocole de cytométrie en flux
1. Préparation des échantillons
- Préparer une suspension cellulaire unique à partir de tissus, de sang ou de cellules en culture par dissociation mécanique, digestion enzymatique ou pipetage doux.
- Pour les cellules adhérentes, les détacher à l’aide de solutions enzymatiques ou de chélateurs du calcium.
- Compter les cellules et évaluer leur viabilité afin de garantir un nombre suffisant de cellules vivantes pour l’analyse.
2. Blocage et marquage
- Bloquer les sites de liaison non spécifiques pour réduire le bruit de fond.
- Incuber les cellules avec des anticorps fluorescents pour détecter les marqueurs de surface.
- Pour les marqueurs intracellulaires, fixer et perméabiliser les cellules après le marquage de surface.
- Utiliser des colorants de viabilité pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes.
3. Lavage et resuspension
- Laver soigneusement les cellules afin d’éliminer les réactifs non liés.
- Resuspendre les cellules dans un tampon compatible avec la cytométrie en flux.
4. Acquisition des données
- Analyser les échantillons dans un cytomètre en flux, où les cellules passent individuellement dans des faisceaux laser.
- Les signaux de fluorescence et de diffusion de la lumière sont détectés pour quantifier les marqueurs cellulaires et les propriétés physiques.
- Inclure des contrôles permettant la compensation et la mise en place des stratégies de gating.
5. Analyse des données
- Utiliser un logiciel spécialisé pour générer des histogrammes et des dot plots.
- Identifier les populations cellulaires et quantifier l’expression des marqueurs.
- Réaliser une analyse multiparamétrique pour un profilage détaillé.
La cytométrie en flux permet une immunophénotypage complet et une caractérisation fonctionnelle des cellules en recherche comme en clinique. Des ajustements du protocole peuvent être nécessaires selon le type d’échantillon, les marqueurs ciblés et les fluorophores utilisés.
