Le quenching consiste à inactiver les enzymes peroxydases endogènes naturellement présentes dans les tissus (comme dans les globules rouges, les macrophages ou les organes tels que le foie, la rate et les reins). Ces enzymes peuvent catalyser la réaction chromogénique (par exemple, le substrat DAB) indépendamment de la liaison anticorps-antigène, provoquant un marquage de fond et des résultats faussement positifs.
Tampons utilisés pour le quenching HRP
Le quenching HRP est généralement effectué en incubant les coupes de tissu dans un tampon contenant du peroxyde d’hydrogène (H₂O₂), un agent oxydant qui inactive irréversiblement les peroxydases endogènes.
- Tampon courant : Solution de peroxyde d’hydrogène à 3 % diluée dans de l’eau distillée ou une solution saline tamponnée (PBS ou TBS). Le pH est généralement neutre (environ 7,0–7,4) pour préserver la morphologie des tissus.
- Alternatives : Certains protocoles utilisent du peroxyde d’hydrogène dilué dans du méthanol (par exemple, 0,3 % H₂O₂ dans du méthanol) pour une pénétration et une efficacité accrues, notamment sur les coupes congelées.
Protocole typique de quenching HRP
- Après déparaffinisation et récupération d’antigène, rincer les lames dans du PBS ou TBS.
- Incuber les coupes dans une solution de peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 à 15 minutes à température ambiante.
- Rincer abondamment dans du PBS ou TBS pour éliminer le peroxyde résiduel.
- Poursuivre avec les étapes de blocage des sites non spécifiques et d’incubation des anticorps.
Importance du choix du tampon dans le quenching
Le tampon utilisé pour diluer le peroxyde d’hydrogène aide à maintenir la stabilité du pH et l’intégrité des tissus. Les tampons les plus couramment utilisés sont :
- PBS (Solution saline tamponnée au phosphate) : Tampon physiologique compatible avec la plupart des protocoles IHC.
- TBS (Solution saline tamponnée au Tris) : Légèrement plus alcalin, parfois préféré en fonction de l’anticorps ou du système de détection.